荧光定量常见问题

荧光定量 pcr 实验常见问题解析

Q1：溶解曲线出现多峰

a）引物设计不够优化：根据引物设计原则重新设计引物。

b）引物浓度太高：适当降低引物浓度。

Q2：扩增曲线形状异常

a）扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。

b）个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心，加样过程中尽量避免吸打出气泡。

c）扩增曲线上飘：仪器测试默认基线设置为 3 至 15 个循环荧光值的标准差，可根据实际扩增情况进行相应基线调整。

Q3：反应结束无扩增曲线出现

a）反应循环数不够：一般设置循环数为 40，但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

b）确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。

c）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃延伸阶段。

d）模板浓度太低：减少稀释程度并重复实验。

e）模板降解：重新制备模板，重复实验。

f）预变性时间不足：本产品采用热启动的 Taq 酶，请确保按照反应程序设置的 2min 预变性时间进行实际操作。

Q4：Ct 值出现太晚

a）扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。

b）模板浓度太低：减少稀释程度，重复实验。

c）模板降解：重新制备模板，重复实验。

d）PCR 产物太长：一般将 PCR 产物长度设计为 70~200 bp 范围内。

e）反应体系中存在 PCR 反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。

f）预变性时间不足：本产品采用热启动的 Taq 酶，请确保按照反应程序设置的 3min 预变性时间进行实际操作。

Q5：阴性对照（NTC）出现明显扩增

a）反应体系或者水被污染：更换新的 Buffer 或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

b）引物二聚体的出现：一般在 35 个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

Q6：重复性差

a）加样体积不准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体系，增加组分加入体积。

b）定量 PCR 仪孔间温度不一致：定期校准仪器。

c）模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

D）阈值设置：对于不同板间的重复试验，请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。

Q7：模板用量 X 是多少？常用的量是多少？

a) X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板 DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30之间的最佳上样量。

b）常用的量是逆转录 500-1000ng 总 RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行 qPCR 实验。

Q8：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议 Ct 值要大于 15？

a)有效性要满足三个条件：

（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增

效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。

（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无

Ct 值。

（3） 熔解曲线：为单一峰。

b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q9：Rox 的作用？

ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正

加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

Q10：为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？

可能原因：

a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0，OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，

若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。

b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

解决方案：

先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度 RNA 重新实验。

b）定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。

Q11：为什么扩增曲线无法达到平台期？

可能原因：

a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太

大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。

b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。

c）试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。

解决方案：

a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。

b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。

c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。

d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）

Q12：为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？

A：较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般 mRNA 反转录后

定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存

在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃

以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。

解决方案：

a）适当提高退火温度；

b）提高模板量，降低引物浓度；

c）重新设计引物。

Q13：为什么出现双峰，双峰Tm 都在 80℃以前？

A：双峰 Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。

Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃

之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。

解决方案：

提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

Q14：为什么出现双峰，并且双峰 Tm 都在 80℃以后？

A：可能原因：

a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。

b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。

解决方案：

a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。

b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。

c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

Q15：为什么是单峰，但Tm 在 80℃之前？

A：可能原因：

扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。

注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA

反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二

聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故

会在 80℃以前出现双峰）。

解决方案：

进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：

新配制无误的反应体系，重新实验。

Q16：为什么是单峰，但峰不尖锐？

可能原因：

存在大小相近的非特异性扩增

解决方案：

a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种

产物）；

b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

Q17：建议 qPCR 实验用几步法？

A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增

效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。

Q18：同一基因复孔间熔解曲线Tm 值有差异？

A：同样的扩增产物也会出现 Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接

受。

Q19：为什么稀释了模板 CT 值反而变小了？

A：一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多

特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT

值变低。

Q20：内参 CT 值小于 20，目的基因均大于 30，怎么办？

A：可能是目的基因为低丰度表达基因导致。

建议：

a）换用内参；

b）换引物；

c）换检测线性范围更广的 qPCR mix。