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  细胞培养常见问题及其解决


1. 如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,其中美国MP Biomedicals公司提供了最全的培养基系列,例如BME  DMEM  F10/F12  MEM  RPMI1640(液态/粉末)。

2. 何时须更换培养基?

视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。 MP Biomedicals公司具有众多的平衡液,

8. 细胞之接种密度为何?

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。

10.冷冻管应如何解冻?

取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于-20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。

13.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

14. 细胞冷冻培养基之成份为何?

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如MP 0219605580 ), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

16.冷冻保存细胞之方法?

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C 30分钟) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至-80 °C 以下, 再放入液氮槽长期储存。-20 °C 不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

18.培养基中是否须添加抗生素?

除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。

19.应如何避免细胞污染?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

原则上:直接灭菌后丢弃之。

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。 推荐使用MP公司的双抗或三抗:

 

 
 

21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?

不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响?

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?

可以选用MP Biomedicals公司的MRA,在0.5 ?g/ml 的工作浓度下通过抑制支原体的DNA螺旋酶来杀死支原体;在0.1?g/ml 的工作浓度下有效预防各种支原体污染;

 

 
 

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之,必要时加入MP公司的双抗。

25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?

培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。

26. 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

不同,可以参考文献选择。

27. 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80 °C 太久。

29.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

 


30.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

31.什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

32.如何用台盼兰计数活细胞?

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/毫升,在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色细胞是死细胞。

33.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

34.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

35.室温下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?

缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同PH值。

50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同PH值





36.胰蛋白酶消化

1. 去除培养基。

2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。

4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)

6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。

7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

 

 
 

37. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?

当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

38.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

39.保存血清最好的方法?

我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

40. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。

41. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。

若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。

42. 为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

43. 有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!

44. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

45. 如何避免沉淀物的产生?

我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:

(1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。

(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。




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